棉铃虫HaABCC2基因克隆及mRNA表达

【摘要】棉铃虫是一种多食性农业害虫,在世界范围内广泛发生。转Bt基因作物自1996年开始在全球范围内推广种植,有效控制了靶标害虫的为害,同时也显著减少了化学杀虫剂的使用。我国自1997年开始推广种植表达Cry1Ac毒素蛋白的Bt棉花,到2012年种植面积已达400万公顷。Bt棉花的广泛种植大大降低了棉花及其他寄主作物上棉铃虫的种群密度。鉴于国外已有田间害虫对Bt作物产生抗性的报道及我国北方棉区部分棉铃虫种群对Cry1AC敏感性下降的事实,棉铃虫对Bt棉花的抗性演化将是Bt棉花持续应用的最大威胁。腺苷三磷酸结合盒式转运蛋白(ATP结合盒式蛋白,ABC转运蛋白)是一类膜整合蛋白,其利用水解ATP的能量对溶质中各种生物分子进行跨膜转运,对维持细胞正常的生理功能起重要作用。已有研究表明ABC转运蛋白超家族成员中的ABCC2基因变异能够引起昆虫对Bt产生抗性。本文克隆了棉铃虫HaABcC2基因的全长cDNA序列,研究了该基因在棉铃虫体内的时空表达,并检测了HaABCC2基因在棉铃虫不同品系间的表达。本文结果表明HaABCC2与所检测的4个棉铃虫品系的Cry1Ac抗性无关。1.克隆棉铃虫HaABCC2基因转运蛋白ABCC2负责在昆虫的肠腔及消化道中富集运送重金属离子、次生代谢物到体外,是昆虫体内新发现的潜在的毒素受体。本研究利用Rr-PCR和RACE技术,克隆了棉铃虫ABCC2transporter的全长cDNA序列。HaABCC2基因的全长cDNA序列大小为4113bp,开放阅读框为4017bp,编码1339个氨基酸,并进行同源性分析得出与棉铃虫HaABCC2基因序列与烟芽夜蛾的相似度最高(93%),与其他昆虫类物种的相似度的取值范围是63％-68％.ABCC2transporter的开放阅读框存在单核苷酸多态性位点。2.棉铃虫HaABCC2基因的时空表达采用实时荧光定量PCR方法,将本实验室饲养的敏感品系在时间上(卵、1-2龄幼虫、3~4龄幼虫、5龄幼虫、雄性蛹、雌性蛹、雄性成虫、雌性成虫)、空间上(5龄幼虫的整头虫体、5龄幼虫的前肠、5龄幼虫的中肠、5龄幼虫的后肠、5龄幼虫的脂肪体、五龄幼虫的马氏管、5龄幼虫的外皮)分别做相对定量PCR,比较HaABCC2基因在时间上、空间上的表达情况。结果表明：1、时间上,从卵到5龄幼虫,目标基因表达量逐渐提高并且各组间有明显差异,到雄性蛹等其余四组的目标基因表达量降低到最低且无明显差异。以雌性成虫HaABCC2基因的相对表达量为1,则HaABCC2基因在各个生长发育阶段的相对表达量分别为卵期(5.50)、1-2龄幼虫(9.16)、3-4龄(13.85)、5龄(26.72)、雌性蛹(2.83)、雄性蛹(1.78)、雄性成虫(1.38)；2、空间上,前肠中的HaABCC2基因的相对表达量水平最高,后肠的、中肠的、马氏管的、脂肪体的HaABCC2基因的相对表达量水平依次降低,外皮的HaABCC2基因的相对表达量最低。以相对表达量最低的外皮的HaABCC2基因的相对表达量为1,则各组织部位的HaABCC2基因的相对表达量分别为前肠(977.04)、后肠(883.32)、中肠(528.44)、马氏管(59.44)、脂肪体(2.83)；此外在整头虫体内的HaABCC2基因的相对表达量为164.72。3.棉铃虫HaABCC2基因在敏感品系与抗性品系间表达量的比较采用实时荧光定量PCR方法,比较了棉铃虫HaABCC2基因在本实验内抗性品系棉铃虫(4个品系)与敏感品系(1个品系)的表达情况。结果表明,HaABCC2基因在棉铃虫敏感品系及四个抗性品系的虫体内中均有表达,并互相之间存在一定的差异。HaABCC2基因在CAD品系中表达量较高,与敏感品系SCD的表达量没有明显差异。目的基因在其余三个抗性品系中的表达量与SCD的相比,均有一定程度的下调,其中：HaABCC2基因在CYTO品系中表达量约为SCD的0.67倍,HaABCC2基因在AY423品系中表达量约为SCD的0.68倍,HaABCC2基因在廊坊品系中表达量约为SCD的0.67倍；并且HaABCC2基因在CYTO品系、AY423品系、廊坊品系中的表达量之间没有明显差异。
【作者】杨帆；
【导师】吴益东；
【作者基本信息】南京农业大学，农业昆虫与害虫防治，2013，硕士
【关键词】棉铃虫；HaABCC2；Cry1Ac；抗性；

【参考文献】
[1]汪燕.ITER中心螺管磁体线圈馈线系统CS1U热分析[D].合肥工业大学,机械电子工程,2013,硕士.
[2]周森.不同冰速下半圆型构件冰作用力试验与研究[D].大连理工大学,港口、海岸及近海工程,2004,硕士.
[3]卜祥洪.预告登记制度研究[D].吉林大学,民商法学,2004,硕士.
[4]冯海宁.顶管施工环境效应影响及对策[D].浙江大学,2003.
[5]文强.论外国人的基本权利主体资格[D].苏州大学,宪法学与行政法学,2013,硕士.
[6]魏嘉翀.北京某地铁盾构下穿既有铁路沉降影响及施工优化分析[D].北京交通大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[7]朱晓丹.朴素贝叶斯分类模型的改进研究[D].厦门大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[8]胡晓亮.天然保鲜剂对马陆葡萄贮藏保鲜效果的影响[D].上海理工大学,食品科学工程,2011,硕士.
[9]杨丹辉,李红莉.基于损害和成本的环境污染损失核算——以山东省为例[J].中国工业经济,2010,07:125-135.
[10]夏忠勇.不同海拔下铅锌硫化矿浮选电化学行为研究[D].北京有色金属研究总院,矿物加工工程,2013,硕士.
[11]张琪.移动广告联盟客户细分研究[D].哈尔滨理工大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[12]胡荣,陈圻,王强.不同理性双寡头R&D竞争分析及混沌控制[J].控制与决策,2010,10:1536-1542.
[13]郭喜平.Nb-Si基超高温合金制备技术及抗氧化硅化物渗层[J].中国材料进展,2015,02:120-125.
[14]邢云龙.油浸式变压器用片式散热器结构优化数值计算研究[D].吉林大学,热能工程,2014,硕士.
[15]李姣.基于湿地依赖—承载力的洞庭湖区系统耦合及对策研究[D].北京林业大学,林业经济管理,2014,博士.
[16]王媛媛.基于判决理论的在线BCI系统的研究与建立[D].大连理工大学,生物医学工程（专业学位）,2013,硕士.
[17]庞海云.突发性灾害事件下应急物资分配决策优化过程研究[D].浙江大学,2012.
[18]唐文章,邓永富.应用神经网络技术求取碎屑岩储层参数[J].石油地球物理勘探,1997,S1:35-40+193.
[19]王雪玮.三伏天中药穴位贴敷与艾灸治疗支气管哮喘的临床对比观察[D].黑龙江中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[20]杜忠军.大跨径钢桁梁悬索桥施工工艺研究[D].重庆交通大学,建筑与土木工程,2011,硕士.
[21]侯西正.基于有源阻尼的单相变频逆变器控制策略研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2014,硕士.
[22]华景山.企业如何开展缜密的防毒措施[J].互联网周刊.2001(26)
[23]陈红江.论考生道德及其建设[D].湖北大学,伦理学,2012,硕士.
[24]谭雪飞.大模场双包层光纤模式理论与模拟研究[D].中国科学院研究生院（西安光学精密机械研究所）,光学,2013,硕士.
[25]王小曼.面向对外汉语教学的类词缀研究[D].安徽大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[26]李春梅,范全润.空间数据挖掘及其在地理信息系统中的应用[J].楚雄师范学院学报,2005,03:6-10.
[27]沈燕,陈光明,周苏明,唐黎明.不同制冷剂用于双回路耦合冰箱性能研究[J].工程热物理学报,2014,04:646-650.
[28]王朝栋.我国商业银行资本充足率与银行效率关系研究[D].山西财经大学,金融学,2013,硕士.
[29]张小伟,吴树祥,赵立新.1200mm平整机轧制压力的图表法计算[J].一重技术.1998(01)
[30]肖能齐.大型低速机推进轴系校中与振动集成计算研究[D].武汉理工大学,轮机工程,2013,硕士.
[31]李常庆.抽油机井实时监控系统研究[D].东北石油大学,石油与天然气工程（专业学位）,2013,硕士.
[32]冀素芳.高中思想政治综合探究活动教学研究[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[33]丁浩,李电生.城市物流配送中心选址方法的研究[J].华中科技大学学报(城市科学版),2004,01:50-51+54.
[34]王业飞.单级功率因数校正LED驱动芯片的研究与设计[D].沈阳工业大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[35]戴稳胜,袁卫,谢邦昌.电信领域的数据挖掘[J].中国统计,2005,06:43-44.
[36]黄美虹.乙型肝炎病毒母婴传播及阻断的相关因素探讨[D].福建医科大学,妇产科学,2014,硕士.
[37]王丽娟,许文奎,尹利斌.开式全断面掘进机刀圈研制[J].一重技术.2000(04)
[38]马静.关于不定方程（57n）~^x+（1624n）~^y=（1625n）~^z[D].西南大学,基础数学,2013,硕士.
[39]邢军.农村高中物理学困生的差异教学研究[D].扬州大学,课程与教学论,2012,硕士.
[40]苏韦.暂予监外执行制度研究[D].安徽大学,诉讼法学,2014,硕士.
[41]武立甲.基于WEB的PLC远程监控系统的研究[D].太原科技大学,控制工程,2013,硕士.
[42]魏德君.试论中国传统居室陈设的发展及当代居室陈设的特点[D].中央美术学院,设计艺术学,2004,硕士.
[43]唐谋凤.武钢一米七热连轧机液压厚度自动控制系统[J].冶金自动化,1982,03:11-15.
[44]张美娟.对外汉语教学中的体态语探析[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[45]彭波.基于SPI的网络密传通道设计与实现[D].湖南大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[46]楚丽梅.城市污水深度处理与氯消毒生态风险控制研究[D].南京大学,环境工程,2013,硕士.
[47]刘彩霞.外表面污垢对矿用空冷器换热性能影响的研究[D].湖南科技大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2013,硕士.
[48]范伟.基于分子光谱的多元校正模型优化与转移方法及其应用研究[D].中南大学,分析化学,2013,博士.
[49]陈曦.关于YKJT财务公司风险管理框架的研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[50]朱毅.国际工程承包商劳务组织风险管理研究[D].清华大学,管理科学与工程,2013,硕士.